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实验动物细菌学监测标准操作规程
点击次数:2066 发布时间:2010-01-20
1. 标本的采集
正常动物细菌检测主要检查呼吸道和肠道,分别取气管分泌物及肠内容物做细菌培养检查。对于发病动物,采取其病变组织和脏器做细菌学检查。
2. 细菌的培养
细菌是单细胞的原核生物,绝大部分都可以在人工培养基上进行繁殖,只有少数例外,如泰泽病原体需在活细胞中繁殖。不同细菌种类所要求的zui适生长条件不尽相同,有些细菌需在有氧的环境下才能生长,称为需氧菌;有些只能在无氧环境下生长,称为厌氧菌;还有一些细菌在有氧、无氧环境下都可以生长,称为兼性厌氧菌。
培养细菌的目的,是从不纯的被检材料中找出特定的细菌或全部细菌,这一过程称为分离培养。如果只是培养性质明确的一种细菌,则称为纯培养。为了从被检材料中分离出所要检查的细菌,可以利用多种性质不同的选择性培养基,检查各种不同的目的细菌。
(1)培养基的种类:按物理性状可把培养基分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基三种。
(2)细菌培养的方法:培养细菌的目的不同,其方法也不尽相同,通常把细菌的培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种:
①一般培养法 一般培养法又称需氧培养法,将已接种好的平皿、斜面或液体培养基等,置于37℃孵育箱内培养18~24h,一般细菌即可于培养基上生长。但也有少数生长缓慢的细菌,需培养2~7d甚至更长时间才能生长。
二氧化碳培养法 某些细菌如脑膜炎奈毖氏菌、布鲁杆菌及肺炎支原体等,需要在一定的二氧化碳环境下才能良好生长,即二氧化碳培养法,常用的有二氧化碳培养箱、烛缸法、重碳酸钠—盐酸法。
③厌氧培养法 有些细菌只能在无氧环境下生长,即厌氧培养法,目前常用的厌氧培养法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱等。
3. 细菌的鉴定和分类
把获得纯培养的细菌进行一系列生物学特性的检查,并确定其分类学上的位置,这个过程叫细菌鉴定。细菌生物学性状包括菌落形态、菌体形态、染色性质、生化反应以及血清学反应特性和特异性噬菌体等。
细菌的分类是根据其营养方式及各种生物学特性亲缘关系,将细菌划分为不同的门、纲、目、科、属、种,其基本分类单位是种。
(1)菌落形态:菌落的特征是识别细菌的重要依据,观察菌落特征时应注意:边缘是整齐的、还是锯齿的,表面是光滑的、还是粗糙的,中间是突起的、还是凹陷的,是透明的、还是半透明或不透明的。如乙型溶血性链球菌,在血琼脂平皿上,菌落灰白色,圆形,中央稍凸起,透明或半透明,表面光滑,菌落周围可见透明的溶血环。而绿脓杆菌,在选择性培养基(NAC)上菌落扁平,边缘不整齐,大小不一,表面湿润、有光泽,菌落周围有蓝绿色或褐色色素扩散,但也有不产生色素的菌株。这些菌落特征在细菌的鉴定中均有一定意义。
(2)细菌的生化反应特性:各种细菌具有各自独特的酶系统,因而在代谢过程中所产生的分解与合成代谢产物也不同。这些代谢产物又各具不同的生化特点。根据此特点,利用生物化学方法来鉴别不同细菌,称为细菌的生化反应试验。生化反应试验方法很多,主要有以下几种:
①糖(醇)类发酵试验:是鉴定细菌的生化反应试验中zui主要的试验,不同细菌可发酵不同的糖类,如沙门菌可发酵葡萄糖,但不能发酵乳糖,大肠杆菌则可发酵葡萄糖和乳糖;即使两种细菌均可发酵同一种糖类,其发酵结果也不尽相同,如志贺菌和大肠杆菌均可发酵葡萄糖,但前者仅产酸,而后者则产酸、产气,故可利用此试验鉴别细菌。
②葡萄糖代谢类型鉴别试验:可用于葡萄球菌与微球菌的鉴别。
③β-半乳糖苷酶试验(ONPG):分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性,如埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属和沙雷氏菌属等。而不发酵乳糖的细菌如沙门菌、变形杆菌和肠杆菌科中其他不发酵乳糖的细菌ONPG试验均为阴性。
④其他生化试验:如淀粉水解试验、七叶苷水解试验、甲基红试验及VP试验等。
(3)革兰氏染色法:染色除能观察细菌形态外,还可根据其染色反应,将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两大类。如沙门菌属、志贺菌属、巴斯德杆菌及耶尔森菌等均为革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌有肺炎链球菌、单核细胞增生性李斯特杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠棒状杆菌等。
(4)血清学鉴定:除生化鉴定外,必要时可进行血清学鉴定。如沙门菌属、志贺菌属、绿脓杆菌、耶尔森菌等均可做血清学分型试验。
根据送检动物的不同级别,对所需检查的病原菌进行逐项排查,zui后得出检测结论。