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生化分析仪常用分析方法
点击次数:2023 发布时间:2010-03-09

生化分析仪常用分析方法共有三大类,分别为终点法、固定时间法和动力学法。

终点法: 指经过一段时间的反应,反应达到平衡,由于反应的平衡常数很大,可认为全部底物(被测物)转变成产物,反应液的吸光度不再变化,只与被测物的浓度有关。这类方法通常称为“终点”法,更确切地说应称“平衡”法。

单试剂单波长终点法:t1时刻加入试剂(体积为V),t2刻加入样本

(体积为S),然后搅拌并反应,之后开始测量反应液的吸光度,

在t3时刻反应达到终点,t3-t2为测定时间。

 

    反应度R=At3-At2-1×V/(V+S),或R=At3-ARBLK。

 

    其中: Ati为i时刻的吸光度,ARBLK为试剂空白吸光度。

单试剂双波长终点法: 基本上同“单试剂单波长终点法”,只是对于每一个测定周期,其实际吸光度等于Aλ1-Aλ2。

双试剂单波长终点法:t1时刻加入*试剂(体积为V1),t2时刻加入                                      样本(体积为S)之后立即搅拌,t3时刻加入第二试剂(体积为V2)                                               并立即搅拌,t4时刻反应达到终点。t3-t2为孵育时间,t4-t3为测定时间。

 

在项目参数中,如果反应起始时间设为0,则反应度R=A时刻吸光度-双试剂空白吸光度。    如果反应起始时间小于0,则反应度R=At4 -双试剂空白吸光度-t3到t2间设定点的吸光度×(V1+S)/(V1+S+V2)。

双试剂双波长终点法: 基本上同“双试剂单波长终点法”,只是对于每一个测定周期,其实际吸光度等于Aλ1-Aλ2。

固定时间法:又称为一级动力学法、二点动力学法等,指在一定的反应时间内,反应速度与底物浓度的一次方成正比,即v=k[S]。由于底物在不断的消耗,因此整个反应速度在不断的减小,表现为吸光度的变化越来越小。这类反应达到平衡的时间很长,理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动时反应较复杂,杂反应较多,必需经过一段延迟时间才能进入稳定反应期。

t1时刻加入试剂(体积为V),之后测量试剂空白的吸光度,t2时刻加入样本(体积为S),t3时刻反应稳定,t4时刻停止对反应进行监测;t2-t3为延迟时间,t3-t4为测定时间。

单波长反应度(单双试剂相同):R=At4—At3

双波长反应度:R=(t4时刻主波长吸光度-t4时刻次波长吸光度)--(t3时刻主波长吸光度-t3时刻次波长吸光度)

动力学法:又称零级动力学法,指反应速度与底物浓度的零次方成正比,也就是与底物浓度无关。因此,在整个反应过程中,反应物可以匀速地生成某个产物,导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加,减小或增加的速度(ΔA/min)与被测物的活性或浓度成正比。动力学法也被称为连续监测法;主要用于酶活性的测定。

    实际上,由于底物浓度不可能足够大,随着反应的进行,底物消耗到一定程度后,反应速度不再为零级,因此,零级动力学法是针对于特定时间段而言的;同样,由于血清成份复杂,反应刚启动时反应较复杂,杂反应较多,必需经过一段延迟时间才能进入稳定反应期,各试剂商对这两段时间有严格规定。

t1时刻加入试剂(体积为V),t2时刻加入样本(体积为S),t3时刻反应稳定,tn时刻停止对反应进行监测;t3-t2为延迟时间,tn-t3为测定时间。 单波长反应度(单双试剂相同)R=(n∑AT-∑A∑T)/[n∑T2-(∑T)2],其中:n=t3到tn间的数据个数 ,T=时间 , A=某一时间的吸光度。双波长反应度基本同单波长,只是某一时间的吸光度等于主波长吸光度减去次波长吸光度。